相差显微镜观察技术：活细胞观察的最佳选择

更新时间：2026-09-10 浏览量：36

导读：普通明场显微镜无法直接观测无色透明活细胞，染色操作又会造成细胞失活。相差显微镜依靠相位转振幅的光学原理，实现无标记、低损伤连续观测。本文解析原理、设备选型、实操要点与适用边界，为细胞实验室提供选型参考

相差显微镜在活细胞观测中的技术定位

相差显微镜（相衬显微镜）可以将透明活细胞产生的不可见光相位差转化为人眼可识别的明暗对比度，全程无需染色、不破坏细胞活性，是体外细胞培养日常质控、细胞形态动态追踪的标配设备，相关光学装置要求收录于 GB/T 2985-2026《生物显微镜》，来源：国家标准化管理委员会，2026 年。数据显示，未经染色活细胞在普通明场显微镜下，有效结构识别率不足 15%；采用相差成像后，透明细胞结构对比度提升 90% 以上，可连续多小时追踪细胞增殖、分裂、迁移状态，来源：中国光学工程学会，2026 年生物显微成像技术白皮书。在干细胞、肿瘤细胞、原代细胞培养实验室中，相差显微镜主要用于每日汇合度评估、细胞形态判读、支原体污染初步筛查，无需取样固定，可直接在培养瓶、培养孔板原位观测，减少细胞污染风险。

活细胞常用显微成像方式对比

成像模式	是否标记染色	光毒性	核心优势	主要局限
相差显微镜	无标记	极低	原位观测活细胞形态，设备成本适中	存在光晕伪影，细微结构定量受限
明场显微镜	需要染色固定	中等	图像色彩真实，适合固定样本	活细胞几乎无对比度，染色致死
荧光显微镜	荧光染料 / 标记蛋白	较高	特异性标记细胞器、靶蛋白	染料存在细胞毒性，长时间观测易光漂白
DIC 微分干涉显微镜	无标记	低	立体感强，光晕弱	对样品厚度、载玻片平整度敏感，价格偏高

相差显微镜核心光学部件为环状光阑 + 带相板的专用相差物镜。光线穿过活细胞时，细胞质、细胞膜、细胞核折射率存在差异，产生微小相位偏移；环状光阑分离直射光与衍射光，物镜内相板改变两类光的相位，通过光干涉形成明暗图像，来源：中国科学院西安光学精密机械研究所，2026 年 4 月。多数细胞实验室会选用倒置相差显微镜，物镜位于样品台下方，可直接放置培养瓶、多孔板，适配长时间活细胞培养观测场景，是细胞房最主流配置。

相差显微镜活细胞观测标准化操作流程

整套观测流程包含光路合轴校准、样品放置、逐级观测、图像采集、数据归档，光路合轴是保障相差成像质量最容易被忽略的关键步骤。

前期校准：根据选用相差物镜，切换对应环状光阑；使用相衬望远镜完成环状光阑与物镜相板合轴，合轴偏移会造成对比度大幅下降。
样品放置：将培养容器直接放置载物台，优先选用标准厚度 0.17mm 盖玻片或专用培养底，避免厚度不匹配引入伪影。
逐级调焦：先用 10× 相差物镜大范围扫描，评估整体细胞状态；切换 20×、40× 相差物镜，观察细胞轮廓、胞内颗粒、分裂相。
图像采集：搭配三目接口显微相机拍照，记录物镜倍率、拍摄视野，用于细胞培养记录与实验资料留存。
结果评估：观察细胞形态、贴壁状态、碎片多少，初步判断是否存在污染、细胞老化；异常样本再转入荧光或生化检测进一步验证。

实操经验提醒：相差成像自带光晕效应，细胞边缘会出现亮环，高浓度细胞堆叠时光晕会叠加干扰判断；拍摄时降低光源亮度，可轻微弱化光晕。

实操选型 FAQ，相差显微活细胞观测高频问题

Q1：相差显微镜观察到细胞形态异常，是否可以直接判定细胞污染？不可以。相差显微镜仅用于初步筛查，部分支原体早期污染、胞内颗粒增多仅能作为预警信号，最终确认需要使用荧光染色或 PCR 方法验证，来源：中国细胞生物学学会，2026 年。 Q2：普通明场物镜能不能当作相差物镜使用？不能。相差物镜内置专用相位板，普通物镜无相位调制结构，即便加装环状光阑，也无法产生相差成像效果，成像没有对比度。 Q3：正置相差和倒置相差显微镜，细胞实验室该如何选择？细胞培养优先选用倒置相差显微镜，培养瓶、多孔板可直接放置样品台；正置相差适合薄涂片、悬浮细胞临时制片，不适合贴壁细胞长时间培养观察。

行业应用发展趋势

活细胞药物筛选、干细胞制剂研发持续推动无标记显微观测技术普及。传统相差显微镜搭配数字成像模块、AI 图像分析，可自动计算细胞汇合度、识别细胞分裂相，减少人工判读误差。行业共识，AI 仅作为辅助定量工具，细胞健康度、污染风险的最终判断，仍需要实验人员人工复核。相差显微镜凭借低光毒、无需标记、操作简便的优势，依然是细胞房基础质控的首选设备，常与荧光模块组合，形成 “相差看形态、荧光看靶标” 的联合表征方案。

参考文献

GB/T 2985-2026《生物显微镜》，国家标准化管理委员会，2026，https://openstd.samr.gov.cn/
2026 生物显微成像技术白皮书，中国光学工程学会，2026，[shturl.cc/c4q6sPqo95ed7X](shturl.cc/c4q6sPqo95ed7X)
活细胞无标记显微成像技术规范，中国细胞生物学学会，2026-05，https://www.cscb.org.cn/
相位差显微成像原理与生物样本应用研究，中国科学院西安光学精密机械研究所，2026-04，https://www.opt.ac.cn/

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